预测糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）全基因组文库中与来自螨虫（Tyrophagus purtiscenticae）的Tyrp25 蛋白互作的相关蛋白。
首先使用Megadock将Spacing和Angle参数调为2和60进行粗筛，可以快速筛选出潜在的有意义的蛋白互作。使用Megadock工具预测拟南芥全基因组文库中与PbRING131-244蛋白互作的相关蛋白是一种高效的计算策略，可用于大规模筛选潜在的蛋白质相互作用。Megadock是一款专门用于蛋白质-蛋白质对接的高效工具，基于快速傅里叶变换（FFT）算法来计算配体与受体之间的空间配对方式。通过FFT加速空间采样，Megadock能够在较短的时间内对大量的蛋白质配体和受体进行对接分析。其主要原理包括：
1.快速傅里叶变换（FFT）：通过FFT算法，Megadock能够快速计算受体和配体在三维空间中的结合模式。这种算法可以在频域中分析配体与受体之间的相互作用，减少对接的计算量。
2.打分函数：Megadock使用能量打分函数来评估每种结合模式的能量状态。常见的打分项包括静电能、范德瓦尔斯力、溶剂可及性等。打分越低的对接结果，通常表明配体和受体之间的结合更稳定。
3.网格化采样：通过在受体分子上建立网格点，Megadock可以在网格点之间进行配体取样。结合FFT，工具能够迅速生成潜在的结合模式，并依靠打分函数筛选出最有可能的结合方式。
Megadock利用以上算法，在结合快速对接和打分的基础上，以极高的效率完成大规模蛋白质的对接筛选。这使得其在拟南芥全基因组这样的较大蛋白库中筛选PbRING131-244蛋白的互作蛋白时非常适用。
Megadock筛选出的前200名得分最高的蛋白质进入Hdock精筛是一个合理的精筛步骤，能够进一步优化对接的精确度。在精筛阶段，通过将Hdock的Spacing参数调整为1.2、Angle参数调整为15，可以显著提升对接结果的细致程度。这样一来，经过Megadock初筛后获得的潜在蛋白质互作对在Hdock精筛中将得到更精确的验证，进一步缩小候选范围，以更高的精确度锁定具备生物学意义的蛋白互作。
合理性分析：
(一)、逐步筛选策略
通过先使用Megadock进行初筛，可在广泛的数据集上快速识别潜在的蛋白互作。此阶段的筛选目的在于迅速锁定具备一定结合能的候选蛋白，而不要求非常高的精度。接着进入Hdock精筛，通过进一步调整参数值，可以将这些候选蛋白的结合模式优化为更高的精度。逐步筛选的策略不仅有效降低了计算成本，同时还能在结果中筛选出最具潜力的候选者。
(二)、合理调整Spacing与Angle参数
Hdock工具中的Spacing参数定义了对接过程中网格点之间的距离。较大的Spacing值适合初筛阶段，可以加快对接速度并在较大空间范围内快速定位结合模式。而在精筛中，将Spacing调为1.2，能够细化网格，使受体表面上的样本位置更为密集，从而在更小的区域中找到更精确的结合位点。
同样，Angle参数定义了对接时配体分子旋转采样的角度步长。粗筛阶段可以使用较大的Angle值，使得每次旋转的角度增量较大，节省计算时间。而在精筛中，Angle值调为15，意味着配体旋转时每次增量更小，这种细致的旋转采样能够提升结合模式的精确性，有助于锁定符合生物学条件的结合模式。
(三)、提升精确度和筛选效率
初筛时较大的Spacing和Angle值，能够快速找到潜在的结合模式，而精筛时较小的Spacing和Angle值，进一步精确对接结果，从而在锁定候选的基础上提升预测的精确性。这样一来，可以确保筛选出的蛋白互作模式具有良好的亲和力和稳定性，为后续的生物学实验验证提供更可靠的参考依据。
这种通过参数的逐步优化实现快速筛选和精细分析相结合的方法，能够在保持筛选效率的同时，提供更为精确的预测结果，是蛋白质互作预测中的一种合理而高效的策略。
Megadock筛选出的得分排名前200的蛋白质进入Hdock精筛阶段是一个合理而有效的策略，主要通过Hdock工具进一步提升预测精度。Hdock的精筛优势在于其更为细致的对接参数设置，可以捕捉到更加准确的蛋白互作模式，为研究者提供更可靠的候选结果。以下将具体说明HDOCK精筛的优势和合理性：
在精筛阶段，通过将Hdock的Spacing参数设置为1.2以及Angle参数设置为15，精筛可以在对接网格和旋转采样中提供更细致的分辨率。Spacing参数控制网格点之间的距离，较小的Spacing值使得网格点分布更加密集，从而在受体表面生成更多精确的样本点，这有助于发现更为精确的结合位点。同时，Angle参数的步长值较小使得配体分子旋转采样更细致，从而更准确地模拟蛋白质复合体的构象。这些精细的参数设置使得Hdock在筛选中能够更好地优化蛋白质互作预测的精度和准确性。
Hdock的优势还体现在它能够配合其他工具，如Megadock，构建多层次的筛选流程。Megadock在初筛时通过快速傅里叶变换（FFT）算法大幅缩短计算时间，但其结果相对偏粗略。通过将初筛中得分最高的前200个候选者转入Hdock精筛阶段，可以有效地利用Hdock工具更高的分辨率和精确性，进一步缩小蛋白互作的候选范围。这种多层筛选策略确保了筛选的效率，同时兼顾了筛选的精度。
Hdock在精筛阶段提供的高度灵活的参数设置，使得工具在不同的研究需求下能够进行调整。研究者可以根据实验的精细程度灵活调整Spacing和Angle参数，从而捕捉到更符合实际生物环境的蛋白互作模式。相比于Megadock，Hdock在对接模式上提供了更多的参数组合选择，特别是在研究需要高精度的蛋白复合体预测时，Hdock工具表现出更高的适应性。
使用Hdock精筛不仅能够提高对接分析的精确度，还能提升预测结果的可靠性。在精筛阶段利用更精细的参数设定，研究者能够排除结合模式不稳定、得分偏低的蛋白互作对象，确保筛选结果的稳定性和亲和力。Hdock的精筛优势在于它能够基于较小的Spacing和Angle值对接参数，识别出更具有生物学意义的结合模式，为后续的实验验证提供可靠的候选数据。
在精筛过程中，Hdock使用了较小的Spacing和Angle值，通过细化网格和增加旋转采样密度来精确定位结合位点。这对于蛋白质对接过程中的分子细节有更高的捕捉能力，可以显著提高对结合位点的准确识别。通过细化这些参数，Hdock的精筛步骤能够更好地描绘出潜在的结合模式，避免错过重要的结合位点。这种高精确度的定位在蛋白互作研究中具有重要价值。
综上所述，将Megadock初筛的前200个高得分候选蛋白导入Hdock进行精筛，是一个科学且合理的实验步骤。Hdock在精筛阶段通过更精细的参数设置，不仅大幅度提升了对接的精确性，同时也显著增强了预测结果的可靠性。这种多层筛选的方法，确保了筛选的效率和精确度，是蛋白质互作预测的有效策略。
在Hdock精筛阶段，通过结合能大小来评估蛋白质互作的稳定性和亲和力，是提升筛选精度的重要手段。结合能是衡量两个蛋白质结合强度的物理化学指标，通常以负值表示，且负值越大，表明结合越稳定。这是因为结合能越低，表明蛋白质互作更具亲和性和稳定性，能够在生物学环境中更容易形成稳定的复合体。Hdock利用这一特点，能够高效地筛选出结合更稳定、亲和力更强的蛋白互作。
在筛选过程中，通常将结合能绝对值大于200视为筛选的重要标准之一。将这一数值作为标准，研究人员能够有效筛除结合能较高的对接模式，保留那些具有较高结合可能性的候选蛋白。绝对值大于200的结合能意味着相互作用的蛋白之间具备较强的能量稳定性。使用该标准来筛选候选蛋白，不仅可以排除一些能量相对较高、不够稳定的对接模式，还能确保筛选出的候选对象在生物环境中更具结合潜力。
这种结合能的筛选方式还能够提高精筛阶段的准确性和筛选效率。在精筛阶段，Hdock依赖低结合能值来优化候选对象，使得筛选出的蛋白对更加符合生物学功能上的需求。通过结合能值的筛选，可以快速识别那些不仅在结构上互补且在能量上稳定的蛋白质互作模式。这种以结合能作为标准的精筛策略，有助于在海量的候选蛋白中快速锁定那些更具生物学意义的蛋白互作，从而为后续的实验验证提供坚实的数据支撑
此外，基于结合能的筛选还使得精筛结果在实际应用中具有更高的参考价值。低结合能值不仅意味着蛋白质间的相互作用稳定，还可以预测其在生物系统中更容易发挥相应的功能。筛选出的这些蛋白互作模式为进一步的生物学验证和功能性研究提供了重要线索，有助于揭示蛋白质在生物学过程中的实际作用。通过这一方式，Hdock工具能够显著提升蛋白质互作预测的精确度，为研究人员提供更为可靠的筛选结果。
将从Hdock筛选出的前10个候选蛋白质互作数据转入AlphaFold3，计算其pTM和ipTM值，是对筛选结果进一步深化和验证的合理步骤。这一操作能够显著提升对蛋白质复合体结构的预测准确性，确保筛选出的蛋白互作对具有高度的生物学相关性。
首先，pTM（预测的TM分数）和ipTM（界面预测TM分数）分别衡量蛋白复合体整体结构和相互作用界面预测的准确性。pTM值是评价复合体整体预测质量的关键指标，而ipTM值则专注于评估蛋白质之间接触区域的精确度。较高的pTM和ipTM值表明模型对蛋白复合体和对接位点的预测具有较高的置信度。这意味着，当pTM和ipTM值较高时，两个蛋白质不仅在整体结构上具有较高的匹配度，其相互作用的界面区域也能够在生物环境中形成较为稳定的结合模式。通过这些指标，研究者能够更直观地判断候选蛋白对的可靠性。
将Hdock筛选出的前10个高分候选蛋白导入AlphaFold3进行pTM和ipTM计算，可以对精筛结果进行更深入的质量评估。Hdock精筛的结合能分析虽然提供了候选蛋白的稳定性信息，但引入AlphaFold3的pTM和ipTM评估，可以通过结构预测进一步验证候选对接位点的可靠性。这一操作的合理性在于：通过进一步确认和优化候选蛋白复合体的结构，使得研究者能够在不同模型和打分标准之间进行综合分析，从而选择出更加准确的互作对。
这种结合不同预测模型的多层筛选策略，能够提高蛋白质互作预测的精度。较高的pTM+ipTM值表明预测出的蛋白质复合体不仅具备稳定的结合，还能够在界面区域上精确对接。通过对这些高分候选进行pTM和ipTM计算，研究者可以将最终候选蛋白锁定在具有高置信度和生物学意义的互作对上。这不仅提高了筛选的精确度，还为后续的生物实验验证和功能性研究提供了更为可靠的数据支持，有助于发现真正具有生物学活性和功能相关性的蛋白互作。
注：pTM值是预测的TM分数，用于评估整体蛋白质三维结构的预测准确性。这个指标预测蛋白质整体折叠的正确性，与实验结构的相似度进行对比；ipTM是界面预测TM分数，用于评估蛋白质复合体中两个相互作用界面的预测准确性。它专门评估两个或多个蛋白质之间接触区域的结构预测准确性。它专门评估两个或多个蛋白质之间接触区域的结构预测准确性。
同时，针对目标基因进行三维结构的构建。该过程使用结构预测工具，通过已知的同源结构或序列比对方法，生成目标蛋白的三维模型。模型构建完成后，利用对接软件将目标基因与拟南芥相关序列进行一对一的对接分析。这一过程不仅有助于识别潜在的蛋白质互作，还能记录对接分数及其他特征值，为后续的筛选和分析提供数据支持。
1.使用Megadock进行初筛，得到plddt值>80的Top200的蛋白-蛋白互作数据。
2.使用Hdock更详细的对接参数对200组蛋白进行批量对接，获得分子对接的结合能分值。
3.使用AF3模型对plddt值>80同时对hdock对接评分最高的10组蛋白和相关TIFY蛋白进行批量对接，获得分子对接的PTM和iPTM分值PLDDT (Per-residue Local Distance Difference Test) 值，是一种评价每个氨基酸残基在蛋白结构预测中的局部置信度的数值，这个值的范围通常在0到100之间，数值越高表示对该残基位置预测的置信度越高，也就是模型的质量越好。
4.整理结果。
在10组蛋白中，诱饵蛋白与ID为1027766.gene，1019236.gene，1008481.gene，1097737.gene的文库蛋白的iptm+ptm值均高于0.75，说明其与诱饵蛋白具有较高的互作可能性。
